Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови

Этап №1

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №1 в период с 05.08.2014 г. по 31.12.2014 г. выполнялись следующие работы:

  • Выполнен аналитический обзор научно-технической, методической литературы по теме ПНИ.
  • Проведены патентные исследования по теме.
  • Определено направление дальнейших исследований для разработки регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний.
  • Определены оптимальные параметры массива нанопроволок, формирующего структуру фотонного кристалла.
  • Разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления.
  • Изготовлены первые экспериментальные образцы подложек биосенсора.
  • Разработана подложка экспериментального образца биосенсора. Подложка будет представлять собой пластину кремния с расположенными на ней 6 аналитическими лунками диаметром 7 мм, что соответствует стандартной лунке 96-луночного планшета, соответствующего стандарту ANSI/SLAS 4-2004 "for Microplates – Well Positions".
  • Изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS,
  • Разработана методика переведения квантовых точек в водную фазу.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

  • Проанализировано более 130 (статей в ведущих журналах, монографий) источников, из которых более 60 источников за 2009-2014г, по следующим направлениям ПНИ: методы детекции онкомаркеров, применение нанопроволок для создания биосенсоров, оптические свойства и методы создания фотонных кристаллов, методы синтеза квантовых точек.
  • Показано, что объект разработки соответствует современному техническому уровню и является патентоспособным.
  • На основе полученных данных определено направление дальнейших исследований для разработки регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний. Биосенсор будет изготавливаться на основе подложки, представляющей собой массив нанопроволочных структур, формирующих фотонный кристалл в планарной геометрии с использованием методов электронно-лучевой литографии и реактивного ионного травления. В качестве базовой методики выявления онкомаркеров был выбран метод ИФА. В качестве детекторных оптических меток будут использованы коньюгаты антител с квантовыми точками CdSe/ZnS. Квантовые точки будут изготовлены путем коллоидного синтеза в органической среде с применением инжекционной методики.
  • Определены оптимальные параметры массива нанопроволок, формирующего структуру фотонного кристалла: будут изготавливаться нанопроволоки круглого сечения, с диаметром 100-250 нм и высотой около 0.8 мкм, расстояние между нанопроволоками порядка 150-300 нм. Такая геометрия массива позволит селективно усилить оптический сигнал флуоресценции квантовых точек в видимой области.
  • На данном этапе разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления. Массив нанопроволок будет изготовлен методом реактивного ионного травления с использованием никелевой маски, создаваемой с помощью электронно-лучевой литографии.
  • Были изготовлены первые экспериментальные образцы подложек биосенсора, представляющих собой массив нанопроволочных структур, и изучена их морфология. По своим параметрам данные массивы удовлетворяют требованиям, указанным в ТЗ.
  • Разработана подложка экспериментального образца биосенсора. Подложка будет представлять собой пластину кремния с расположенными на ней 6 аналитическими лунками диаметром 7 мм, что соответствует стандартной лунке 96-луночного планшета, соответствующего стандарту ANSI/SLAS 4-2004 "for Microplates – Well Positions".
  • Методом коллоидного синтеза в органической среде были изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS, имеющие квантовый выход фотолюминесценции >90% в органической фазе. Ядра CdSe были изготовлены по инжекционной методике, впоследствии на них в режиме послойного наращивания была нанесена оболочка ZnS.
  • Разработана методика переведения квантовых точек в водную фазу. Получен ряд водорастворимых КТ, стабилизированных различными производными полиэтиленгликоля с различными значениями поверхностного заряда. Изучена коллоидная стабильность водорастворимых КТ при различных значениях рН. Полученные образцы водорастворимых КТ обладают квантовым выходом люминесценции 57% и стабильны в водных растворах при физиологических значениях рН, как минимум, в течение 3 месяцев при хранении на +4.

 

Полученные на первом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №2

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №2 в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработан метод подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
  • Разработан способ подачи и забора аналита в зону массива нанопроволочных структур.
  • Оптимизированы условия активации массива нанопроволочныхструктур аффинным реагентами, специфичными к целевым белкам.
  • Разработаны методики изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроводного биосенсора.
  • Разработаны методики регенерации биосенсора для повторного использования.
  • Разработаны методики получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
  • Изготовлены экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
  • Разработаны программы и методики испытаний экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
  • Произведено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

  • Разработан метод подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами: для этого были отработаны условия химической модификации поверхности биосенсора. В результате на поверхность были введены карбоксильные функциональные группы, необходимые в дальнейшем для иммобилизации распознающих антител. Разработана методика подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
  • Разработан способ подачи и забора аналита в зону массива нанопроволочных структур, который включает пробоподготовку аналита (образцов сыворотки крови человека) и внесение аналита в зону массива нанопроволочных структур в ручном режиме с помощью механического дозатора.
  • Проведена оптимизация условий активации массива нанопроволочных структур аффинным реагентами, специфичными к целевым белкам. Проведена научно-исследовательская работа по иммобилизации как модельных, так и целевых антител на поверхность нанопроволочного массива. Подобраны оптимальные условия для эффективной иммобилизации антител без существенной потери их функциональной активности.
  • Разработана методика изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроволочного биосенсора. Проведена иммобилизация распознающих антител, детекция антигена с использованием конъюгатов квантовых точек с распознающими антителами, и регенерация сенсора. Разработан. Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсора для регистрации целевых белков.
  • Разработана методика регенерации биосенсора, позволяющая проводить до 5 циклов регенерации.
  • Разработана методики получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
  • Изготовлены экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител, специфичных к простатическому специфическому антигену, с квантовыми точками. Исследована активность и стабильность полученных конъюгатов.
  • Разработана программа и методика испытаний экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками, которая включает ряд физико-химических и иммунологических методов исследования конъюгатов.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

 

Полученные на втором этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №3

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №3 в период с 01.08.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Изготовлены экспериментальные образцы биосенсора.
  • Разработана методика экспериментальных исследований оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок (подложки биосенсора), а также оптических характеристик получаемых биосенсоров.
  • Разработана программа и методика экспериментальных исследований экспериментальных образцов биосенсоров.
  • Проведены дополнительные патентные исследования, подготовлена заявка на получение патента.
  • Разработан способ корпусирования биосенсора для адаптации конструкции к применению в стандартных флюоресцентных ридерах для ИФА.
  • Проведены испытания экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
  • Произведено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

  • Изготовленные экспериментальные образцы регенерируемого нанопроволочного био-сенсора, представляют собой массив нанопроволок на поверхности кремниевой пластины, функцио-нализированный распознающими антителами, специфичными к целевым белкам.
  • Была разработана методика экспериментальных исследований оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок (подложки биосенсора), а также оптических характеристик получаемых биосенсоров. Была разработана установка для измерения оптических характеристик фотонных кристаллов. Данные работы позволят провести исследование исследования оптических свойств фотонных кристаллов и биосенсоров на 4-м этапе проекта.
  • В результате работ 2-го и 3-го этапов подана заявка на патент на изобретение – способ создания экспериментального образец регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.
  • Разработанный способ корпусирования показал по результатам испытаний полную совместимость со стандартыми флуоресцентными ридерами.
  • Экспериментальные образцы конъюгатов детекторных антител с квантовыми точками выдержали испытания: на гистограмме распределения частиц по гидродинамическому диаметру имелся один симметричный пик со средним значением не более 30 нм.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

 

Полученные на третьем этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №4

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №4 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Проведено исследование оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок, а также оптических характеристик экспериментальных образцов биосенсоров
  • Изучено влияние параметров массивов нанопроволок, формирующих фотонный кристалл, на оптические характеристики биосенсора, чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора
  • Изучено влияние параметров морфологии нанопроволок, формирующих фотонный кристалл, на оптические характеристики биосенсора, чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора
  • Изучено влияние способа модификации поверхности нанопроволок на возможность введения функциональных групп для дальнейшей ковалентной иммобилизации антител
  • Изучено влияние способа ковалентной иммобилизации антител на поверхность нанопроволок, а также их концентрации на чувствительность к целевым белкам
  • Изучено влияние состава регенерирующего раствора (рН, ионная сила, наличие детергентов и др.), а также условий промывки на качество регенерации и повторной работы биосенсора
  • Разработана технология изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроводного биосенсора
  • Проведены дополнительные патентные исследования, подготовлена заявка на получение патента
  • Разработан проект инструкции по эксплуатации, согласно ГОСТ 2.610-2006.
  • Изготовлены коньюгаты детекторных антител с квантовыми точками
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ
  • Подготовлен чертеж общего вида биосенсора

При этом были получены следующие результаты:

  • Определены оптимальные параметры массивов нанопроволок и их морфологии: гексагональная структура с размером ячейки 280 нм, диаметром проволоки 100 нм и высотой 600 нм.
  • Показано, что расстояние между нанопроволоками во многом играет определяющую роль с точки зрения достижения максимальной чувствительности. Установлено, что оптимальные по своим характеристикам биосенсоры могут быть сконструированы на основе массивов нанопроволок со следующими параметрами: расстояние между нанопроволоками – 280 нм, диаметр единичной нанопроволоки – 100 нм.
  • Установлено, что оптимальные по своим характеристикам биосенсоры могут быть сконструированы на основе массивов нанопроволок со следующими параметрами: расстояние между нанопроволоками – 280 нм, диаметр единичной нанопроволоки – 100 нм.
  • Было установлено, что окисление поверхности нанопроволок необходимо проводить в растворе серной кислоты и перекиси водорода в соотношении 3/1, разбавленном деионизованной водой в 3 раза, в течение 2 часов.
  • Показано, что для прочного связывания и сохранения биосенсорами высокой эффективности детекции целевых белков оптимальным является проведение ковалентного связывания антител с помощью карбодиимидной реакции в течении 30 минут и при 25°С.
  • Показано, что наиболее эффективен регенерирующий раствор, представляющий собой 0,1М глицин – HCl буфер, рН 2,8.
  • Разработан «Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсора для регистрации целевых белков».
  • Проведены дополнительные патентные исследования согласно ГОСТ Р 15.011-96, подготовлена заявка на получение патента «Универсальный адаптер для использования микрочипов планарного типа в планшетных ридерах для иммунофлуоресцентного анализа».
  • Разработан проект инструкции по эксплуатации, согласно ГОСТ 2.610-2006.
  • Индустриальным партнером в соответствие с пунктом 3.10 ТЗ были изготовлены стабильные и функционально активные конъюгаты КТ (с максимумом флуоресценции при длине волны 560 нм) с моноклональными антителами, специфичными к CEA и CA 27.29 в количестве 0,4 мг и 0,3 мг соответственно
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ
  • Подготовлен чертеж общего вида биосенсора в соответствии с ГОСТ 2.102-68.

 

Полученные на четвертом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на заключительном этапе выполнения соглашения.

 

Этап №5

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №5 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Изготовление экспериментальных образцов биосенсоров по скорректированному лабораторному регламенту.
  • Разработка и изготовление экспериментального образца корпусного адаптера для использования биосенсора со стандартными флуоресцентными ридерами, используемыми в лабораторной клинической практике
  • Разработка программы и методики испытаний экспериментальных образцов биосенсора
  • Проведение испытаний экспериментальных образцов биосенсоров, изготовленных по скорректированному лабораторному регламенту, в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний.
  • Проведение дополнительных патентных исследований. Подготовка заявки на получение патента
  • Оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ.
  • Разработка технических требований и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики
  • Разработка проекта технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытного образца регенерируемого биосенсора для детектирования маркеров заболеваний в сыворотке крови».
  • Проведение работ по достижению показателей результативности проекта.
  • Материально-техническое обеспечение работ

При этом были получены следующие результаты:

  • Экспериментальные образцы биосенсора изготовлены в соответствие с лабораторным регламентом, соответствуют ТЗ (3.24, 4.2.1, 4.2.4) и могут быть испытаны по разработанной Программе и методикам испытаний экспериментальных образцов биосенсора согласно плану-графику, а также могут быть использованы для детекции онкомаркеров: СА 15-3, свободного и связанного PSA, CEA и CA 27.29 в сыворотке крови.
  • Разработан и изготовлен экспериментальный образец корпусного адаптера для использования биосенсора со стандартными флуоресцентными ридерами, используемыми в лабораторной клинической практике, обеспечивающий выполнение пункта 4.2.6 ТЗ. Подготовлен чертеж общего вида экспериментального образца корпусного адаптера.
  • Разработана программа и методики испытаний экспериментальных образцов биосенсора, которая позволит провести соответствующую проверку соответствия биосенсора требованиям ТЗ.
  • Проведены испытания экспериментальных образцов биосенсоров, изготовленных по скорректированному лабораторному регламенту, в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний:
a. В соответствии с документом «Программа и методики экспериментальных исследований экспериментальных образцов биосенсора» проведена проверка по п. 4.2 «Проверка чувствительности образцов биосенсора, изготовленных согласно скорректированному лабораторному регламенту, к целевым белкам». Показано, что при использовании сконструированных согласно скорректированному по результатам проведенных на предыдущем этапе работ по ПНИ исследований экспериментальных образцов биосенсора зависимость флуоресцентного сигнала сенсора от концентрации целевых белков в анализируемых растворах (для всех пяти видов исследуемых белков) имеет линейный характер. Также продемонстрирована высокая воспроизводимость измеряемых значений интенсивности флуоресцентного сигнала. Полученные данные свидетельствуют о высокой точности и достоверности детекции целевых белков во всем исследуемом диапазоне их концентраций в анализируемых растворах. Результаты проведенных исследований соответствуют требованиям по п.4.1.2. Технического задания.

b. Проведена проверка по п. 4.2 документа «Программы и методики экспериментальных исследований экспериментальных образцов биосенсора» «Проверка времени анализа образцов, содержащих целевые белки, с использованием биосенсора, изготовленного согласно скорректированному лабораторному регламенту». Установлено, что среднее время анализа всех целевых белков с использованием образцов биосенсора, изготовленных согласно скорректированному лабораторному регламенту, не превышает 180 минут, что соответствуют требованиям по п.4.1.2. Технического задания.

c. Проведена проверка возможности повторного использования биосенсора для детекции целевых белков. Продемонстрировано, что образцы биосенсора, сконструированные согласно скорректированному на основе проведенных на предыдущем этапе работ по ПНИ и состоящие из шести отдельных массивов нанопроволок с оптимальными морфологическими параметрами, обеспечивают возможность как точной детекции целевых белков (что подтверждается высокой сходимостью результатов, полученных на данном и предыдущем этапах работы), так и эффективной регенерации биосенсоров. Показано, что с использованием образцов биосенсоров можно проводить не менее пяти повторных циклов «детекция целевого белка – регенерация», сохраняя при этом достаточный для достоверного анализа уровень флуоресцентного сигнала и точность измерений. Результаты проведенных исследований соответствуют требованиям по п.4.1.2. Технического задания.

d. Проведена проверка возможности одновременной идентификации целевых белков с использованием экспериментальных образцов биосенсора. Продемонстрировано, что сконструированные образцы биосенсора, состоящие из массивов нанопроволок с оптимальными морфологическими характеристиками и оптимизированные в ходе выполнения работ над проектом методики анализа обеспечивают возможность количественной высоко специфической детекции целевых белков. Показано, что с использованием биосенсоров возможно анализировать как растворы, содержащие один вид целевых белков, так и несколько. При этом не было зафиксировано ложного срабатывания биосенсора, что подтверждает высокую селективность анализа. Результаты проведенных исследований соответствуют требованиям по п.4.1.2. Технического задания.

 

  • Выполнено дополнительное патентное исследование, согласно ГОСТ Р 15.011-96 (пункт 5.2 ТЗ) и подана заявка на патент (пункт 5.4 ТЗ), частичная версия которой приведена в отдельном документе (см. «Заявка на патент «Регенерируемый нанопроволочный биосенсор для регистрации маркеров заболеваний»»), также приложены информационная карта РИД и уведомление ФИПС о поступлении заявки.
  • Проведена оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ. Проведен анализ проделанной работы по проекту за все пять этапов. Установлено соответствие полученных результатов целям и задачам ТЗ.
  • Разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
  • Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытного образца регенерируемого биосенсора для детектирования маркеров заболеваний в сыворотке крови».
  • Проведены работы по достижению показателей результативности проекта.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

 

 

Полученные на пятом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта.

 

39