Разработка аналитической системы на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного выявления биомаркеров онкозаболеваний

Этап №1

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.578.21.0054 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №1 в период с 23.09.2014 г. по 31.12.2014 г. выполнялись следующие работы:

  • Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
  • Проведены патентные исследования по ГОСТ Р 15.011-96.
  • Выполнен выбор и обоснование направления исследований; разработка медико-технических требований, в том числе определение основных медико-биологических характеристик, чувствительности тест-системы, круга определяемых биомаркеров онкозаболеваний, порядок работы с тест-системой.
  • Создана экспериментальная база, обеспечивающая проведение исследований и разработок в течении всего срока проекта: закупка полного комплекта оборудования, материалов и организация рабочего пространства для проведения экспериментальной работы.
  • Разработаны методы синтеза полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветов с высоким квантовым выходом.
  • Разработка методики получения водорастворимых полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветом с высоким квантовым выходом.
  • Разработана методика стабилизации водорастворимых полупроводниковых влуоресцентных нанокристаллов различных цветов в водных растворах.
  • Собрана коллекции биологических образцов сыворотки крови пациентов с злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы.

При этом были получены следующие результаты:

  • Завершен полный анализ научно-технической литературы с 2010 по 2014 г. по характеристике свойств флуоресцентных нанокристаллов, современным диагностическим приложениям нанокристаллов, имеющимся научно-техническим решениям и перспективам разработки новых систем детекции биологических маркеров.
  • Дополнена, систематизирована и проанализирована информация по суспензионным системам детекции биомаркеров, защищенным российскими и международными патентами.
  • На основании проведенного аналитического обзора современной научно-технической, нормативной и методической литературы, а также патентных исследований обоснован выбор направления исследований; разработаны медико-технические требования в том числе определены основные медико-биологические характеристики, чувствительность тест-системы, круг определяемых биомаркеров онкозаболеваний, порядок работы с тест-системой.
  • Заключены договоры и осуществлена поставка полного комплекта оборудования и материалов, организовано рабочее пространство для проведения экспериментальной работы, полностью укомплектована экспериментальная база обеспечивающая проведение исследований и разработок в течение всего срока проекта.
  • Разработаны методы синтеза полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов с диапазоном флуоресценции 515-680 нм.
  • Разработана методика получения водорастворимых полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов с диапазоном флуоресценции 515-680 нм и высоким квантовым выходом.
  • Разработана методика стабилизации водорастворимых полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов с диапазоном флуоресценции 515-680 нм и высоким квантовым выходом.
  • Собрана коллекция биологических образцов сыворотки крови пациентов с злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы в количестве 50 образцов (40 образцов сыворотки крови от пациентов с раком молочной железы, 10 образцов от пациентов с доброкачественными новообразованиями молочной железы).

На первом этапе получены уникальные образцы нанокристаллов и микросферы с помощью соответствующих разработанных методик, а также собрана коллекция биологических образцов сыворотки крови пациентов. Эти материалы в дальнейшем могут быть использованы для создания экспериментального образца новой аналитической тест-системы.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №2

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.578.21.0054 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №2 в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработана технология получения составных компонентов аналитической тест-системы, в том числе: популяции водорастворимых и биосовместимых нанокристаллов разного цвета и популяции микросфер, кодированных отдельными типами флуоресцентных нанокристаллов или комбинацией флуоресцентных нанокристаллов разного цвета.
  • Разработана технология получения и получены распознающие молекул (антитела; однодоменные антитела) для создания аналитической тест-системы на основе микросфер, оптически кодированных полупроводниковыми нанокристаллов.
  • Продолжены работы по сбору коллекции биологических образцов сыворотки крови больных пациентов и здоровых доноров.
  • Размещена информация о ПНИ на сайтах ЛНБИ и МИФИ.
  • Разработаны конструкции, кодирующие распознающие молекулы для создания экспериментальных образцов суспензионных микрочипов.
  • Разработаны методики получения распознающих молекул в форме однодоменных антител, специфичных к определенному виду онкологического биомаркера.
  • Разработаны методики конъюгации полноразмерных и однодоменных антител с микросферами, оптически кодированными флуоресцентными нанокристаллами.
  • Произведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа.

При этом были получены следующие результаты:

  • Разработана точная и хорошо воспроизводимая технология получения составных компонентов аналитической тест-системы: биосовместимых нанокристаллов разного цвета; оптически кодированных флуоресцентных микросфер разного размера. Получены популяции водорастворимых и биосовместимых нанокристаллов с максимумами флуоресценции на 512, 515, 530, 532, 548, 575, 578, 581, 585, 590, 610, 630, 638, 640 нм. Полученные нанокристаллы применялись для оптического кодирования различных популяций микросфер, имеющих диаметры 2.69, 3.0, 4.08, 4.5, 4.88, 5.29, 6.1, 8.24, 8.97, 9.75 мкм и характеризующихся различными химическими свойствами поверхности.
  • Разработана эффективная технология и получены распознающие молекулы (полноразмерные антитела, фрагменты антител, однодоменные антитела) для создания аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов. Получены образцы распознающих молекул в форме модифицированных однодоменных и полноразмерных антител, а также их фрагментов, специфичных к белковым маркерам онкологических заболеваний женской репродуктивной системы: к раковоэмбриональному антигену, CA15-3, CA27-29, CA125, HER2/neu, SCCA. Подобраны эффективные высокоспецифичные рабочие пары распознающего и детектирующего антитела для детекции каждого индивидуального маркера составе многопараметрической системы анализа.
  • Коллекция биологических образцов сыворотки крови человека дополнена новыми образцами (44 образца сыворотки крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также 60 образцов сыворотки здоровых доноров).
  • Проведена популяризация результатов проводимых исследований в СМИ, размещена информация о ПНИ на сайтах ЛНБИ и МИФИ.
  • Разработаны конструкции, кодирующие распознающие молекулы в форме модифицированных однодоменных антител, специфичных к раковоэмбриональному антигену и содержащих различные аффинные таги на с-конце молекул.
  • Разработана методика получения распознающих молекул в форме модифицированных однодоменных антител, специфичных к раковоэмбриональному антигену и содержащих различные аффинные таги на с-конце молекул.
  • Разработана методика конъюгации однодоменных и полноразмерных антител, а также их фрагментов с микросферами, оптически кодированными флуоресцентными нанокристаллами.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ.
  • По результам исследований и разработок опубликовано 2 статьи в научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и "Сеть науки" (WEB of Science).

 

Полученные на втором этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта. Разработанные технологии и методики, а также созданная продукция, будут использованы для создания и тестирования новой аналитической тест-системы.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №3

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.578.21.0054 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №3 в период с 01.07.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработан лабораторный регламент изготовления аналитической тест-системы;
  • Разработана эскизная конструкторская документация на экспериментальный образец аналитической тест-системы.
  • Изготовлены экспериментальные образцы аналитической системы;
  • Разработаны программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов аналитической тест-системы.
  • Проведены испытания экспериментальных образцов аналитической тест-системы на примерах детекции индивидуальных биомаркеров онкологических заболеваний.
  • Произведена оценка характеристик аналитической тест-системы в соответствии с медико-техническими требованиями.
  • Произведена оценка потенциала многопараметрической детекции сигнала для одновременного количественного определения панели биомаркеров онкозаболеваний.
  • Произведена оценка стабильности микросфер, оптически кодированных полупроводниковыми нанокристаллами.
  • Завершен сбор коллекции биологических образцов сывороток крови пациентов с злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы.
  • Проведены дополнительные патентные исследования.
  • Проведена сертификация и паспортизация коллекции сывороток пациентов больных раком и здоровых доноров для обеспечения исследовательских ис-пытаний экспериментальных образцов аналитической тест-системы на клинических образцах.
  • Разработано программное обеспечение для статистической обработки результатов испытаний аналитической тест-системы.
  • Произведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа.

При этом были получены следующие результаты: 

  • На основе результатов предыдущих этапов выполнения проекта разработан лабораторный регламент изготовления аналитической тест-системы.
  •  Разработана детальная эскизная конструкторская документация на экспериментальный образец аналитической тест-системы.
  • Изготовлены экспериментальные образцы аналитической тест-системы, включающие в себя: набор из 6 популяций спектрально кодированных микросфер, с иммобилизованными на их поверхности распознающими молекулами, специфичными к онкомаркерам CEA, CA15-3, CA27-29, CA125, фрагмент p105 белка HER2/neu и SCCA; набор из 6 типов калибровочных агентов - онкомаркеров; набор из 6 типов детекторных биотинилированных моноклональных антител, специфичных к онкомаркерам CEA, CA15-3, CA27-29, CA125, фрагмент p105 белка HER2/neu и SCCA; конъюгат стрептавидина с флуоресцентной меткой.
  • Разработаны программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов аналитической тест-системы.
  • На основе разработанных программы и методик проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов аналитической тест-системы, которые включали определение коэффициентов вариации результатов измерений в трех технических повторах, предварительное определение диагностической точности, чувствительности и специфичности тест-системы. Произведена оценка характеристик аналитической тест-системы в соответствии с медико-техническими требованиями: изучена воспроизводимость калибровочных кривых, проведена предварительная оценка аналитической тест-системы, проведены тест на «открытие» и тест на линейность.
  • Произведена оценка потенциала многопараметрической детекции сигнала для одновременного количественного определения панели биомаркеров онкозаболеваний. Для этого были проведены испытания на выборке из 20 образцов сыворотки крови человека. Произведена оценка стабильности микросфер, оптически кодированных полупроводниковыми нанокристаллами. Для этого был разработан СОП по оценке стабильности микросфер.
  • Закончен сбор коллекции биологических образцов сывороток крови. По итогам работ составлен сертифицированный каталог, включающий паспорта на все образцы сывороток.
  • Проведены дополнительные патентные исследования для оценки конкурентноспособности разрабатываемой тест-системы. Подана заявка о выдаче патента Российской Федерации на изобретение.
  • Разработано программное обеспечение «ОнкоДиагноСтат» для статистической обработки результатов испытаний аналитической тест-системы.
  • Проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа.
  • По результам исследований и разработок опубликовано 2 статьи в научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus.

 

Полученные на третьем этапе результаты полностью соответствуют задачам, поставленным в Плане-графике и в Техническом задании. Образцы аналитической тест-системы позволяют производить мультипараметрический анализ 6 маркеров в образце сыворотки крови. По результатам всех проведенных испытаний, тест-система по чувствительности, воспроизводимости и надежности определения опухолевых маркеров сопоставима со стандартными иммуноферментными тест-системами, каждая из которых позволяет определять лишь один маркер. Разработанная программа «ОнкоДиагноСтат», включающая статистический ROC-анализ, корреляционный анализ а также статистический анализ по методу Манна-Уитни, позволяет оценить потенциал разрабатываемой тест-системы в сравнении с «золотым стандартом» клинической практики – методом ИФА.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №4

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.578.21.0054 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №4 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Определены и уточнены характеристики экспериментальных образцов аналитической тест-системы.
  • Произведена корректировка конструкции аналитической тест системы на основе данных предварительных исследовательских испытаний.
  • Проведены исследовательские испытания 1200 (тысячи двухсот) экспериментальных образцов аналитической тест-системы с использованием 100 сывороток пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также 40 здоровых доноров.
  • Произведено сравнение разработанной аналитической системы с существующими современными ИФА методами детекции онкомаркеров.
  • Подготовлен семинар по результатам и перспективам ПНИ.
  • Проведены дополнительные патентные исследования.
  • Подготовлен участок для опытного производства разрабатываемой аналитической тест-системы.
  • Проведено масштабирование технологии синтеза полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов и изготовления экспериментальных образцов аналитической тест-системы в условиях производства.
  • Осуществлено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа

 

При этом были получены следующие результаты:

 

  1. Определены и уточнены характеристики экспериментальных образцов аналитической тест-системы на большом количестве образцов тест системы с использованием большего, чем на предыдущем этапе, количества сывороток крови пациентов, что позволило получить более достоверные усредненные характеристики тест-системы. По трем независимым экспериментам рассчитали среднее значение концентрации каждого из маркеров в каждой сыворотке, среднеквадратичное отклонение и коэффициент вариации, а также параметры чувствительности и специфичности детекции.
  2. Выполнена корректировка конструкции аналитической тест системы на основе данных предварительных исследовательских испытаний: в рамках, установленного в Техническом задании диапазона флуоресценции микросфер, кодированных нанокристаллами, изменены характеристики флуоресцентных квантовых точкек, а также диаметр одной из популяций микросфер для увеличения эффективного разделения по размерным свойствам и размер одного из полимеров для более эффективной иммобилизации распознающих молекул на поверхности оптически кодированных сфер.
  3. Проведены исследовательские испытания 1200 экспериментальных образцов аналитической тест-системы с использованием 100 сывороток пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также 40 здоровых доноров. С помощью полученных образцов аналитической тест-системы произведен многопараметрический анализ 6 маркеров в образцах сыворотки крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также здоровых доноров.
  4. Выполнено сравнение разработанной аналитической системы с существующими современными ИФА методами детекции онкомаркеров. По результатам проведенных исследовательских испытаний, тест-система по чувствительности, воспроизводимости и надежности многопараметрического определения опухолевых маркеров сопоставима со стандартными иммуноферментными тест-системами, каждая из которых позволяет определять лишь один маркер в одном тестировании.
  5. Проведен семинар по результатам и перспективам проекта. Программа представлена на сайте ЛНБИ НИЯУ МИФИ.
  6. Проведены дополнительные патентные исследования для оценки конкурентноспособности разрабатываемой тест-системы. Подана заявка о выдаче патента Российской Федерации на изобретение.
  7. Выполнен ремонт помещения и подготовлен участок для опытного производства разрабатываемой аналитической тест-системы в соответствии с Техническими требованиями.
  8. Осуществлено масштабирование технологии синтеза полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов и всех последовательных этапов изготовления экспериментальных образцов аналитической тест-системы в условиях производства.
  9. Проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ.

 

Полученные на четвертом этапе результаты полностью соответствуют задачам, поставленным в Плане-графике и в Техническом задании. Результаты работ, проведенных на четвертом этапе, будут использованы для следующей серии исследовательских испытаний экспериментальных образцов аналитической тест-системы, в также для разработки инструкции по применению аналитической тест-системы, технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации тест-системы с учетом технологических возможностей индустриального партнера.

 

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №5

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.578.21.0054 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №5 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Проведены дальнейшие исследовательские испытания 800 (восьмисот) экспериментальных образцов аналитической тест-системы с использованием 60 сывороток пациентов с злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также 20 здоровых доноров.
  • Разработана инструкция по применению аналитической тест-системы.
  • Выполнена разработка технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации тест-системы с учетом технологических возможностей индустриального партнера.
  • Разработан проект ТЗ на проведение ОКР по теме: «Разработка опытно-конструкторской и технологической документации для получения производственной серии тест-системы на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного одновременного выявления биомаркеров онкологических заболеваний.
  • Проведено обобщение результатов ПНИ, в том числе оценка полноты решения задачи и выполнения поставленной цели ПНИ.
  • Выполнена разработка ТУ на набор реагентов аналитической тест-системы.
  • Проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ

 

При этом были получены следующие результаты:

 

  • Проведены исследовательские испытания 800 экспериментальных образцов аналитической тест-системы с использованием 60 сывороток пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также 20 здоровых доноров. С помощью полученных образцов аналитической тест-системы произведен многопараметрический анализ 6 маркеров в образцах сыворотки крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также здоровых доноров.
  • Разработана инструкция по применению аналитической тест-системы. В разработанной инструкции подробно описаны лабораторные процедуры, необходимые для проведения многопараметрического качественного и количественного анализа биологических образцов сыворотки крови с помощью аналитической тест-системы.
  • Сформулированы технические требования и подготовлены предложения по разработке, производству и эксплуатации тест-системы. Дальнейшее масштабирование объемов производства и степень автоматизации будет определяться производственными мощностями и возможностями индустриального партнера.
  • Разработан проект ТЗ на проведение ОКР, в котором подробно описаны цели выполнения ОКР и тактико-технические требования к производимому изделию, а также приведен перечень составных частей аналитической системы, требования назначения, требования к упаковке, маркировке, транспортировке, хранению тест-системы и ее утилизации.
  • Проведено обобщение результатов ПНИ, в том числе оценка полноты решения задачи и выполнения поставленной цели ПНИ. Продемонстировано, что поставленные цели и задачи полностью выполнены и в процессе работы по ПНИ представлена вся необходимая отчетная документация в соответствии в Планом-графиком Соглашения о предоставлении субсидии.
  • Выполнена разработка ТУ на набор реагентов аналитической тест-системы. В ходе разработки ТУ на набор реагентов были определены технические требования и нормы химических показателей на набор реагентов аналитической тест-системы, подробно описан состав каждой составной части аналитической тест-системы и сформулированы требования безопасности.
  • Проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ

 

Таким образом, полученные на заключительном пятом этапе результаты полностью соответствуют задачам, поставленным в Плане-графике и в Техническом задании. Разработанная тест-система, предназначенная для одновременного определения онкомаркеров злокачественных опухолей женской репродуктивной системы (рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки), может быть эффективно внедрена в лабораторную клиническую практику медицинских учреждений для систематического скрининга и своевременной дифференциальной диагностики различных нозологических форм онкологических заболеваний.

39