19. Разработка новых нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов квантовых точек, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, и однодоменных антител

Выполнение работ по теме:

"Разработка новых нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов квантовых точек, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, и однодоменных антител" (номер контракта: 14.584.21.0012)

Этап №1

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от "30" января 2015 г. № 14.584.21.0012 в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №1 в период с 30.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы для определения технического уровня используемых подходов и тенденций их развития в области применения инфракрасных квантовых точек (ИК КТ) для биомедицинских приложений.
  • Проведены патентные и информационные исследования для установления соответствия объекта разработки современному техническому уровню и его конкуренто и патентоспособности.
  • Разработана методика солюбилизации ИК КТ.
  • Разработана методика стабилизации ИК КТ в водных растворах.
  • Иностранным партнером (Поханг Университет науки и технологии, Южная Корея) выполнен синтез ИК КТ типа ядро/оболочка состава CuInS2/ZnS и Ag2S, имеющих максимум фотолюминесценции в области 700-1700 нм и квантовым выходом фотолюминесценции не менее 30%.

При этом были получены следующие результаты:

  • С помощью анализа современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме ПНИ изучены преимущества и будущие перспективы применения нанозондов для молекулярной визуализации опухолевых маркеров в культуре клеток и в животных моделях in vivo с помощью конъюгатов КТ.
  • В соответствии с ГОСТ 15.011-96 проанализирована информация о применении ИК КТ для биомедицинских приложений, нанозондах для визуализации с помощью конъюгатов КТ флуоресцирующих в ИК области спектра с однодоменными антителами (одАТ), защищенная российскими и международными патентами, для определения технического уровния используемых подходов и их тенденций развития в области применения ИК КТ для биомедицинских приложений.
  • На основании проведенного аналитического обзора современной научно-технической, нормативной и методической литературы, а также патентных исследований обоснован выбор направления и план исследований.
  • Разработана методика солюбилизации ИК КТ с помощью липоевой кислоты. Квантовый выход солюбилизированных КТ составил 34%.
  • Разработана методика стабилизации ИК КТ в водных растворах гибридными соединениями, состоящими из остатков этиленоксида и алифатической гидрофобной цепи, а также имеющие различные заряженные концевые функциональные группы. В результате были получены стабилизированные водорастворимые ИК КТ, которые содержат различные функциональные группы, с помощью которых можно произвести конъюгацию квантовых точек с одАТ.
  • Иностранным партнером разработана методика синтеза в органической фазе КТ, люминесцирующих в ИК области (CuInS2 и AgS2). Разработана методика нанесения на поверхность КТ оболочки широкозонного полупроводника для повышения стабильности увеличения квантового выхода люминесценции. Наработаны и переданы в ЛНБИ для дальнейшего исследования две партии КТ, люминесцирующих в ИК области: CuInS2/ZnS и Ag2S/AgInS2/ZnS.образом, на первом этапе выполнения работ по ПНИ были получены уникальные популяции стабилизированных водорастворимых ИК КТ, имеющие различные свойства поверхности и содержащие на поверхности различные функциональные группы, с помощью которых можно произвести конъюгацию квантовых точек с одАТ методами химического ориентированного связывания.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №2

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от "30" января 2015 г. № 14.584.21.0012 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №2 в период с 01.07.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработана методика получения модифицированных рекомбинантных однодоменных антител, специфичных к опухолевому маркеру Her2.
  • Разработана методика ориентированной конъюгации модифицированных рекомбинантных одАТ и ИК КТ.
  • Иностранным партнером (Поханг Университет науки и технологии, Южная Корея) проведен анализ цитотоксичности солюбилизированных ИК КТ в модельных экспериментах in vitro и in vivo.

При этом были получены следующие результаты:

  • Разработана методика получения модифицированных рекомбинантных одАТ, специфичных к опухолевому маркеру Her2 и изготовлены одАТ, специфичные к опухолевому маркеру Her2. Полученные модифицированные рекомбинантные одАТ содержат в составе молекулы одну молекулу биотина, расположенную ориентированно и стерически удаленно по отношению к активному центру связывания антигена, что повышает специфическую активность нанозонда.
  • Разработана методика ориентированной конъюгации модифицированных рекомбинантных одАТ с ИК КТ. В результате ориентированной конъюгации модифицированных рекомбинантных одАТ с ИК КТ изготовлен нанозонд специфичный к опухолевому маркеру Her2 размер, которого составил 14,89 нм.
  • Иностранным партнером выполнен анализ цитотоксичности солюбилизированных квантовых точек в модельных экспериментах in vitro и in vivo. Полученные данные подтверждают высокий потенциал использования квантовых точек составов CuInS2/ZnS и Ag2S/AgInS2/ZnS в практических и медицинских целях.

Показано, что использование нанозонда малого размера позволит успешно преодолеть существующие ограничения по чувствительности детекции, выйдя на детекцию одиночных раковых клеток. При этом, благодаря использованию усовершенствованных КТ, флуоресцирующих в ИК области спектра, и высокоспецифичных одАТ для получения высокоэффективного нанозонда компактного размера будет, достигнут качественно новый уровень разрешения при визуализации гетерогенности опухолевых тканей для детекции границ распространения патологического процесса.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Этап №3

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от "30" января 2015 г. № 14.584.21.0012 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №3 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработана методика испытаний нанозондов в культурах клеток.
  • Разработаны рекомендации по испытанию нанозондов в культурах клеток.
  • Разработаны СОП по синтезу ИК КТ.
  • Иностранным партнером (Поханг Университет науки и технологии, Южная Корея) исследованы и охарактеризованы нанозонды с целью их использования для визуализации клеточных культур, включая тесты на специфичность и определение соотношения сигнал/шум при визуализации.

При этом были получены следующие результаты:

  • Разработана методика испытаний нанозондов на основе конъюгатов инфракрасных квантовых точек с однодоменными антителами, специфичными к опухолевому маркеру Her2, в культурах модельных линий клеток человека in vitro: линии клеток рака молочной железы SK-BR-3 с повышенным уровнем экспрессии опухолевого маркера Her2 и контрольной линии аденокарциномы молочной железы MCF-7.
  • Разработаны рекомендации по методике испытаний нанозондов в культурах клеток. Рекомендации позволяют оптимизировать результаты, полученные при проведении испытаний нанозондов на основе конъюгатов инфракрасных квантовых точек с однодоменными антителами, специфичными к опухолевому маркеру Her2, в культурах раковых клеток, экспрессирующих маркер Her2 и достигнуть высокой чувствительности детекции.
  • Разработаны СОП по синтезу ИК-КТ состава CuInS2/ZnS и Ag2S, характеризующихся высокой воспроизводимостью геометрических размеров, оптических свойств и химических свойств поверхности.
  • Иностранным партнером выполнен сравнительный анализ специфичности и соотношения сигнал/шум при использовании нанозондов на основе конъюгатов ИК КТ с одАТ к опухолевому маркеру Her2 для визуализации в культуре клеток.

 

Полученные экспериментальные данные и материальные результаты третьего этапа обеспечат дальнейшее испытание полученных нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов КТ, флуоресцирующих в ИК области спектра, и одАТ в животных моделях in vivo.

 

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап №4

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от "30" января 2015 г. № 14.584.21.0012 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №4 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. выполнялись следующие работы:

  • Разработана методика испытаний нанозондов на животных моделях in vivo.
  • Разработаны рекомендации по испытанию нанозондов на животных моделях in vivo.
  • Проведена оценка полноты решения задач и выполнения поставленной цели ПНИ.
  • Разработан проект технического задания на ОКР по теме: «Разработка новых нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов квантовых точек, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, и однодоменных антител».
  • Результаты ПНИ размещены на сайтах ЛНБИ, МИФИ и иностранного партнера.
  • Иностранным партнером (Поханг Университет науки и технологии, Южная Корея) выполнено исследование и характеризация нанозондов для визуализации опухолевого маркера HER2 на животных моделях in vivo, для сравнительного анализа срецифичности и возможности визуализации при исследовании целого организма.

 

При этом были получены следующие результаты:

  • Разработаны методика и рекомендации по испытаниям нанозондов на животных моделях in vivo. Разработанные подходы позволяют достигнуть высокой специфичности связывания диагностических нанозондов на основе конъюгатов инфракрасных квантовых точек с однодоменными антителами к опухолевому маркеру HER2, с перевиваемой опухолью человеческого рака молочной железы, клетки которой экспрессируют маркер HER2, что, в перспективе, дает возможность использования данного типа нанозондов для высокочувствительной диагностики злокачественных новообразований на животной модели in vivo с использованием перевиваемых опухолей человеческого рака молочной железы.
  • Определены критерии и проведена оценка полноты решения задач и выполнения цели ПНИ. Показано, что ходе выполнения работ по ПНИ основные цели достигнуты, а поставленные задачи выполнены. Научно-технические результаты и разработанная документация в рамках каждого из этапов обладают высокой новизной, актуальностью, практической значимостью и составлены с учетом всех необходимых требований.
  • Разработаны СОП ориентированной конъюгации модифицированных рекомбинантных однодоменных антител с инфракрасными КТ и подготовлен проект ТЗ на проведение ОКР по теме «Разработка новых нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов КТ, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, и однодоменных антител».
  • Результаты ПНИ размещены на сайтах ЛНБИ, МИФИ и иностранного партнера.
  • На заключительном этапе проекта были проведены дополнительные патентные исследования и подано две заявки на патент: 1) патент № 2016149211 от 14.12.2016 «СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ», РФ; и 2) патент № 2016149210 от 14.12.2016 «СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И НАПРАВЛЕННОГО РАЗРУШЕНИЯ РАКОВЫХ КЛЕТОК», РФ.
  • Иностранным партнером выполнено исследование и характеризация нанозондов для визуализации опухолевого маркера HER2 на животных моделях in vivo, для сравнительного анализа срецифичности и возможности визуализации при исследовании целого организма. Показано, что полученный диагностический нанозонд, представляющий из себя конъюгат инфракрасных квантовых точек с однодоменными антителами и распознающий опухолевый маркер HER2, обладает высокой чуствительностью и специфичностью при визуализации HER2 in vivo. Таким образом, экспериментальный подход, выбранный для исследований нанозонда в животной модели in vivo является оптимальным для тестирования нанозонда, потенциальное использование которого для детекции опухолевого маркера в клинической и хирургической практике имеет большую вероятность успеха.

 

Полученные экспериментальные данные и материальные результаты четвертого этапа послужат основой для внедрения новых нанотехнологических разработок к созданию методов прижизненной визуализации и диагностики опухолевого роста и метастазирования.

41